NGS配套方案
來源：本站 作者：admin 時(shí)間：2019/1/15
NGS配套方案
前言
高通量測(cè)序技術(shù)（又稱二代測(cè)序技術(shù)）是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing）。高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序(Deep sequencing)。目前高通量測(cè)序平臺(tái)的代表是Illumina、ABI。
二代測(cè)序經(jīng)典路線大致如下： 得到初始樣本（Retsch冷凍研磨樣本制備系統(tǒng)+耶拿C16核酸抽提系統(tǒng)）→初始樣本質(zhì)控與定量（NanoDrop One超微量分光光度計(jì)或Bio-Tek Epoch分光光度計(jì)+Qubit 3.0）→初始樣本片段化（Covaris M220或Bioruptor）→ Fragment Clean up、加接頭或建庫過程中的液體處理（Caliper自動(dòng)化工作站：Zephyr或Sciclone NGS）→特定大小片段回收、去除接頭（Blue Pippin）→文庫質(zhì)控及 定量（Qsep1）→PCR擴(kuò)增（耶拿TAdvanced SG PCR儀）→測(cè)序及生物信息學(xué)組裝/分析（Partek Genomics Suite）
具體方案如下：
一、 樣本處理
冷凍混合研磨儀MM400
冷凍混合研磨儀MM400的研磨罐在水平方向上進(jìn)行圓弧式徑向振動(dòng)。罐內(nèi)的球體由于其慣性作用對(duì)位于光滑的研磨罐內(nèi)額壁上的樣品進(jìn)行帶有高能量的撞擊，并以此粉碎樣品。研磨罐的轉(zhuǎn)動(dòng)加上研磨球的運(yùn)動(dòng)對(duì)樣品產(chǎn)生了高強(qiáng)度的混合作用。通過使用多個(gè)小球甚至可以進(jìn)一步的提高混合的效果。當(dāng)使用很多個(gè)小球時(shí)（如玻璃球），生物細(xì)胞就可以被破碎了。球與球之間的摩擦撞擊作用可以有效導(dǎo)致細(xì)胞的破碎。
冷凍混合研磨儀MM400應(yīng)用實(shí)例
纖維組織、骨頭、頭發(fā)、化學(xué)品、藥丸、藥材、藥片、礦物質(zhì)、金屬礦石、合金、玻璃、陶瓷、土壤、污泥、植物組織、谷物顆粒、油籽料、合成材料、廢料樣品、毛料、塑料、RoHS樣品以及紡織品等。
二、 核酸提取
全自動(dòng)核酸提取儀InnuPure C16 touch
智能：人性化試劑盒設(shè)計(jì)
預(yù)裝封膜試劑條/板，一次可同時(shí)提取1-16個(gè)樣品。所有試劑盒都是即用型，日常操作非常簡(jiǎn)單省時(shí)。試劑盒無需分裝，節(jié)省大量分液時(shí)間，最大限度減少人工操作。預(yù)裝試劑也避免了人工分裝可能出現(xiàn)的錯(cuò)加/漏加，加樣過程中因多加而導(dǎo)致的溢液污染。同時(shí)試劑盒中包括提取所需的全部試劑/耗材和預(yù)裝試劑，無需您額外購買。
歷史：25年以上的高精度移液經(jīng)驗(yàn)
可靠性：有效避免交叉污染
獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：移液頭穿孔功能，避免了撕膜帶來的試劑間污染
1ml帶濾芯的槍頭，避免了移液頭和樣品之間的污染
預(yù)裝封膜的試劑，避免了試劑分裝的污染
UV燈滅菌，有效消除批次間樣品的污染
運(yùn)行時(shí)儀器前門完全封閉，阻隔外部環(huán)境污染
三、 DNA質(zhì)控
此款符合人體工程學(xué)的獨(dú)立式分光光度計(jì)具有高分辨率和觸摸屏界面設(shè)計(jì)，使您離研究目標(biāo)更進(jìn)一步。 強(qiáng)大的自動(dòng)調(diào) 節(jié)光程技術(shù)有助于準(zhǔn)確測(cè)量濃縮樣品而無需稀釋。
Acclaro 樣品智能技術(shù)
Acclaro 技術(shù)可以在提供準(zhǔn)確的定量測(cè)定的同時(shí)，增強(qiáng)用戶對(duì)樣品質(zhì)量的了解。 對(duì)污染物的早期鑒別能夠避免下游應(yīng)用的失敗，從而節(jié)省故障排除的時(shí)間。
在數(shù)秒內(nèi)驗(yàn)證樣品結(jié)果 - 鑒別樣品污染物并獲得矯正的濃度結(jié)果。
通過警報(bào)獲取信息 – 通過提供相應(yīng)的技術(shù)支持和解決問題向?qū)?，從而獲得樣品質(zhì)量的即時(shí)反饋。
依靠準(zhǔn)確結(jié)果——采用嵌入式傳感器和數(shù)字影像分析技術(shù)，確保測(cè)量完整性。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 特點(diǎn)
同時(shí)包含基座和比色皿檢測(cè)模塊，以擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)靈活性和擴(kuò)大動(dòng)態(tài)范圍。
測(cè)量稀釋樣品，執(zhí)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)并獲取細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度測(cè)量結(jié)果。
比色皿檢測(cè)模塊包括溫度控制和攪拌區(qū)域。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 增強(qiáng)功能
符合人體工程學(xué)的獨(dú)立式設(shè)計(jì) – 集成 Android? 平板而無需單獨(dú)的計(jì)算機(jī)，能夠通過無線網(wǎng)絡(luò)*、以太網(wǎng)或 USB 實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的無縫傳輸。
自動(dòng)測(cè)量與自動(dòng)調(diào)零功能 –降下檢測(cè)臂即可實(shí)現(xiàn)即時(shí)測(cè)量，以此簡(jiǎn)化多樣品處理流程。 僅需觸摸一下屏幕，即可實(shí)現(xiàn)這些功能的“開”或“關(guān)”。
更廣的動(dòng)態(tài)范圍——采用自動(dòng)調(diào)節(jié)光程技術(shù)，無需對(duì)高濃度樣品（dsDNA 高達(dá) 27,500 ug/μL）進(jìn)行稀釋
集成式學(xué)習(xí)中心——僅需指尖滑動(dòng)，即可瀏覽經(jīng)存檔的技術(shù)支持文檔與教學(xué)動(dòng)畫。
四、 DNA定量
Qubit® 熒光定量?jī)x
與傳統(tǒng)紫外分光法不同，Qubit®3.0采用專門的熒光檢測(cè)技術(shù)和染料，特異性的區(qū)分出DNA，RNA，降解核酸，游離核苷酸及蛋白質(zhì)，即便在低濃度下也具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。
選擇性——采用熒光染料，特異識(shí)別并定量dsDNA， oligos，RNA，microRNA
準(zhǔn)確——比傳統(tǒng)紫外分光光度計(jì)更加準(zhǔn)確
靈敏——最低檢測(cè)1uL樣品，準(zhǔn)確定量濃度僅為10 pg/uL 的DNA和12.5 ug/mL的蛋白
簡(jiǎn)單——易于使用的觸摸屏界面和Android系統(tǒng)，全新的雙核處理器加快計(jì)算速度
五、 DNA片段化
Covaris
M220自動(dòng)聚焦聲波基因組剪切儀
自動(dòng)聲波聚焦（Adaptive Focused Acoustic?, AFA)技術(shù) ，是將高速發(fā)展的醫(yī)用超聲顯像診斷（低強(qiáng)度聚焦超聲）與體外震波碎石治療（高強(qiáng)度聚焦超聲）的技術(shù)優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，并與先進(jìn)的微處理器及機(jī)器控制結(jié)合起來，可以應(yīng)用在多種生命科學(xué)研究中。AFA技術(shù)原理實(shí)質(zhì)上是一個(gè)受控的液體空腔化的動(dòng)力學(xué)過程，簡(jiǎn)單可理解為：當(dāng)聲波通過液體時(shí)，產(chǎn)生的微小氣泡迅速膨脹，隨后由于液體迅速返回空穴導(dǎo)致氣泡崩潰，從而產(chǎn)生液流剪切力，Covaris AFA技術(shù)就是通過控制這種氣穴作用來控制剪切力，即成百上千個(gè)空化氣泡的累加作用，產(chǎn)生的液流沖擊力>100m/sec，AFA技術(shù)即通過計(jì)算機(jī)控制和儀器及耗材各部分的精確設(shè)計(jì)，從而控制作用在樣本上的剪切力將核酸剪切到目的大小。（如下簡(jiǎn)圖）
空氣氣泡 氣泡崩潰產(chǎn)生液流剪切力
二代測(cè)序應(yīng)用領(lǐng)域：
還沒有參考序列的物種：在基因組水平上進(jìn)行重頭測(cè)序（de novo sequencing），獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；
有參考序列的物種：進(jìn)行全基因組重測(cè)序（resequencing），在全基因組水平上掃描并檢測(cè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。
轉(zhuǎn)錄組水平：進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（whole transcriptome resequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP）等研究；
轉(zhuǎn)錄組水平：與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)相結(jié)合，從而檢測(cè)出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點(diǎn)。
小分子RNA測(cè)序（small RNA sequencing）：通過分離特定大小的RNA分子進(jìn)行測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。
二代測(cè)序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用--目標(biāo)序列捕獲測(cè)序技術(shù)（Targeted Resequencing）。這項(xiàng)技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)這些區(qū)段進(jìn)行測(cè)序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen ，應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測(cè)序?？茖W(xué)家們目前認(rèn)為外顯子組測(cè)序比全基因組重測(cè)序更有優(yōu)勢(shì)，不僅僅是費(fèi)用較低，更是因?yàn)橥怙@子組測(cè)序的數(shù)據(jù)分析計(jì)算量較小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。
目前，外顯子組測(cè)序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。
以上領(lǐng)域的測(cè)序都需要進(jìn)行核酸片段化，M220是目前最主要的片段化工具。
六、 PCR擴(kuò)增
Biometra TAdvanced 96 PCR儀
有鍍金純銀樣品槽、金色合金等多種樣品模塊可選，實(shí)現(xiàn)高效傳熱品槽通量靈活，有96孔、60孔、384孔等，模塊可更換精準(zhǔn)的溫度控制：通過智能的溫度控制系統(tǒng)RAC實(shí)現(xiàn)快速的升降溫變化、優(yōu)異的溫度準(zhǔn)確性和均一性，以及高度的重復(fù)性線性溫度梯度工具（LGT）：實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的溫度梯度設(shè)置和控制，極大地方便了退火溫度的優(yōu)化（帶溫度梯度的型號(hào)）高性能智能熱蓋（HPSL）：深凹的熱蓋設(shè)計(jì)可有效地將熱量控制在熱蓋內(nèi)，防蒸發(fā)效果極佳靜音技術(shù)（WQT）：運(yùn)行時(shí)非常安靜，無噪音，提供舒適的工作環(huán)境巧妙的散熱設(shè)計(jì)：通過儀器后部和底部進(jìn)行高效散熱，儀器旁邊可放置其他儀器，節(jié)省實(shí)驗(yàn)室空間儀器自檢功能：可進(jìn)行自動(dòng)的檢測(cè)診斷，提供各種運(yùn)行和故障信息
七、 RNA樣本質(zhì)量控制
Bioptic Qsep1生物分析儀
Qsep1生物分析儀是一款便攜式毛細(xì)管電泳儀，基于毛細(xì)管電泳中待測(cè)樣品在電場(chǎng)作用下離子遷移速度不同而對(duì)組分進(jìn)行分離和分析的原理，克服傳統(tǒng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)耗時(shí)耗力有污染等弊端而研發(fā)的一款高性能的全自動(dòng)化毛細(xì)管核酸分析儀。它既可用于電泳分離，同時(shí)對(duì)每一個(gè)片段的大小進(jìn)行精確測(cè)定和濃度定量。
Qsep1生物分析儀的操作系統(tǒng)非常簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)化了繁復(fù)的操作與流程，能讓一般用戶在5分鐘內(nèi)學(xué)會(huì)操作系統(tǒng)，1分鐘分析樣品得出結(jié)果。它將傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的多個(gè)繁雜步驟：包含樣品準(zhǔn)備、配膠、點(diǎn)樣、跑膠、拍照及結(jié)果判讀，整合簡(jiǎn)化為單一步驟。使用可拋棄式卡夾，使復(fù)雜的生物樣本分析以快速、精確、低成本的方式得以實(shí)現(xiàn)。其高通量、高分辨率、高靈敏度、全自動(dòng)、標(biāo)準(zhǔn)化、無污染的特點(diǎn)賦予了其強(qiáng)大的檢測(cè)分析功能。
Qsep1生物分析儀可代替?zhèn)鹘y(tǒng)凝膠電泳，適用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、教學(xué)實(shí)驗(yàn)室、快速檢測(cè)中心、戶外檢測(cè)等需要快速出結(jié)果、樣本量少的實(shí)驗(yàn)室。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
Qsep1生物分析儀，采用可拋棄式的預(yù)制膠卡夾，即插即用，全自動(dòng)進(jìn)樣，無須人工制膠、灌膠、上樣，免去了手工制膠的繁瑣和人工上樣的 誤差，可用于核酸質(zhì)控和PCR產(chǎn)物電泳，分辨率高，重復(fù)性好，可處理1-8個(gè)任意個(gè)數(shù)樣本，真正實(shí)現(xiàn)了核酸片段和蛋白的快速、自動(dòng)化、高通量、高分辨率 分析。
全自動(dòng)進(jìn)樣：自動(dòng)分析1-8個(gè)樣本
拋棄式卡夾：無需制膠，灌膠，每支卡夾可分析100-300樣品（DNA,RNA和Protein）
快速分析：可達(dá)1分鐘內(nèi)/樣品
高靈敏度：可達(dá)pg級(jí)
高分辨率：最佳可達(dá)1-4bp
結(jié)果呈現(xiàn)：數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，凝膠成像圖，毛細(xì)管電泳圖
軟件分析：同時(shí)進(jìn)行定性及定量分析，界面友好，操作人性化
樣品需求和消耗：最低樣品需求量1μL，上樣量小于0.1μL
低成本：市場(chǎng)上最經(jīng)濟(jì)的儀器和耗材費(fèi)用
應(yīng)用：
?遺傳分析 ?限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (RFLP)
?PCR 產(chǎn)物檢測(cè) ?質(zhì)粒DNA酶切，構(gòu)造及純度分析
?Genomic DNA & NGS 質(zhì)控 ?高分辨率多重PCR分析
?DNA 引物質(zhì)控（Primer QC) ?STR/微衛(wèi)星（SSR）
?總RNA，cRNA，片段化RNA，micro-RNA質(zhì)控 ?合成寡核苷酸片段分析
八、 樣本定量
熒光定量基因擴(kuò)增儀qTOWER3
來自德國耶拿的全新一代熒光定量基因擴(kuò)增儀qTOWER3 touch系列，采用獨(dú)特的4個(gè)高效LED固態(tài)光源作為激發(fā)光源，并通過專利性的光纖掃描系統(tǒng)來采集熒光信號(hào)，確保市面上常用的熒光定量PCR染料都能得到出色穩(wěn)定的激發(fā)和檢測(cè)。靈活的檢測(cè)通道配置，升級(jí)方便，最高可實(shí)現(xiàn)六重目的基因的同時(shí)檢測(cè)。耶拿公司具有近三十年的基因擴(kuò)增儀研發(fā)制造歷史，快速且耐用的鍍金純銀樣品槽使其96孔溫度均一性達(dá)到± 0.15 ℃。選配的12列線性溫度梯度功能使用戶能快速確定最佳的PCR退火溫度進(jìn)而優(yōu)化反應(yīng)條件，是用戶優(yōu)化PCR程序的得力助手。用戶可以選擇用電腦來操控儀器，也可以選擇用彩色觸摸屏來操控儀器。它具有開放的試劑和耗材系統(tǒng)，適用于標(biāo)準(zhǔn)的96孔PCR板、8聯(lián)管或者PCR單管。
快速反應(yīng)：
鍍金純銀樣品槽，最大升溫速率為8℃/s，熱導(dǎo)性好，且耐腐蝕抗氧化
精準(zhǔn)控溫：
溫度準(zhǔn)確性為±0.1 ℃，96孔的溫度均一性為±0.15 ℃，精準(zhǔn)的溫度控制帶來穩(wěn)定且特異性好的擴(kuò)增效果
線性溫度梯度：
獨(dú)特的12列線性溫度梯度功能，能幫助用戶快速找到最精準(zhǔn)的退火溫度
自動(dòng)熱蓋：
采用先進(jìn)的自動(dòng)熱蓋技術(shù)，儀器自動(dòng)控制熱蓋的壓力，確保有效的防蒸發(fā)效果
耗材開放：
對(duì)耗材沒有特殊要求，用戶可自由選擇96孔板、8聯(lián)管或單管，使用方便
高強(qiáng)度寬光譜的激發(fā)光源：
采用藍(lán)色、綠色、紅色、白色（RGBW）四個(gè)高強(qiáng)度長(zhǎng)壽命LED固態(tài)光源，確保在整個(gè)光譜檢測(cè)范圍內(nèi)都有很強(qiáng)的光強(qiáng)，提高檢測(cè)靈敏度，而且不發(fā)熱，使用壽命長(zhǎng)，終身免維護(hù)
高靈敏度檢測(cè)器：
最新型的通道式光電倍增管檢測(cè)器，檢測(cè)靈敏度更高
快速掃描檢測(cè)：
8道光纖掃描檢測(cè)快速，即使完成六通道的96孔掃描，也只需要6s
無需光路校正：
掃描檢測(cè)能確保每孔的信號(hào)激發(fā)和檢測(cè)光程都完全一致，無需光路校正，因此無需額外占用一個(gè)校正通道，可實(shí)現(xiàn)真正的六通道基因檢測(cè)
檢測(cè)通道配置靈活：
用戶可根據(jù)需求靈活選擇通道數(shù)和各通道的檢測(cè)濾光片組, 有12種不同波長(zhǎng)的濾光片組可選擇以配置成1-6通道的檢測(cè)系統(tǒng)，包括濾光片錯(cuò)配的FRET檢測(cè)組合和專用于蛋白熔解曲線分析的濾光片組，覆蓋從藍(lán)光到紅光的全光譜，通道數(shù)可以隨時(shí)方便升級(jí)，以滿足未來更多的檢測(cè)需求
九、 片段回收
Blue Pippin全自動(dòng)核酸片段回收系統(tǒng)
Blue Pippin
回收的片段范圍：50bp－50kp
樣品通量：1－5個(gè)樣品
回收效率：50－80％
創(chuàng)新的技術(shù)
Pippin Prep系統(tǒng)包括一次性的5泳道預(yù)制膠電泳槽，一個(gè)帶有DNA熒光檢測(cè)光路單元(非紫外)的電泳平臺(tái)。
運(yùn)行中，軟件通過實(shí)時(shí)光路檢測(cè)，和參考泳道中的DNA ladder進(jìn)行比對(duì)，確定已經(jīng)設(shè)置回收長(zhǎng)度范圍的DNA片段到達(dá)洗提泳道(elution channel)的準(zhǔn)確時(shí)間
通過電極切換，打開洗提泳道，使目標(biāo)片段進(jìn)入洗提通道的回收室中，從而實(shí)現(xiàn)回收。然后電極再次切換，洗提泳道關(guān)閉，剩余的DNA分子進(jìn)入原先的分離泳道(separation channel)。
自動(dòng)化核酸片段回收 VS傳統(tǒng)切膠回收
手工切膠回收Pippin Prep/Blue Pippin 幾個(gè)小時(shí)的手工操作 幾分鐘的手工操作 回收的核酸片段大小不精確 精確回收指定大小范圍的核酸片段 存在小分子量（LMW）污染 去除小分子量（LMW）污染 30-50％的回收效率 50-80％的回收效率 回收中、小核酸片段 可以回收大的核酸片段
應(yīng)用范圍
下一代測(cè)序，亞克隆，轉(zhuǎn)基因等等
小分子量或者大分子量的核酸片段回收
大小很近的核酸片段的區(qū)分回收
珍貴的微量樣品中的核酸片段回收
